Thème E : molécules et assemblages moléculaires photoactifs pour les applications biologiques et biomédicales

Nouvelles molécules pour des applications biologiques et biomédicales.

Analogues photoactivables de NADPH ciblant les synthases d'oxyde nitrique (J. Xie, N. Bogliotti, S. Maisonneuve)

Les synthases d'oxyde nitrique (NOS) catalysent la formation de NO en utilisant le NADPH comme donneur d'électrons. Nous avons conçu et synthétisé une nouvelle série d'analogues de NADPH photoactivables absorbant à deux photons (NT), portant un ou deux groupe(s) carboxyméthyle(s) sur la ou les position(s) 2’ -et/ou 3’- du ribose de l’adénosine, à la place du groupe 2’-phosphate qui diffèrent par la nature du donneur d'électrons dans leur chromophore photoactivable (remplaçant le groupement nicotinamide). Ces composés présentent une bonne affinité pour la nNOS et la eNOS, ce qui confirme que le groupe carboxyméthyle peut être utilisé comme substitut du phosphate. Nous avons constaté que deux composés, ceux portant un seul groupe carboxyméthyle sur la position 3’ du ribose, se colocalisent avec l'appareil de Golgi (le principal emplacement intracellulaire de la eNOS) et présentent une forte luminosité intracellulaire à deux photons. De plus, une photooxydation dépendante de la eNOS a été observée pour ces deux composés seulement, qui est accompagnée d'une production substantielle de NO intracellulaire expliquant les effets photocytotoxiques spécifiques. Par conséquent, nous montrons pour la première fois que la photoactivation du NT déclenche efficacement un flux d'électrons au niveau de la eNOS et augmente la production basale de NO par les cellules endothéliales alors qu'aucune fluorescence détectable du NT n'a été obtenue dans les cellules HeLa.

Cyclodextrine fluorescente (J. Xie, S. Maisonneuve, R. Métivier)

Nous avons développé une β-cyclodextrine substituée par des DCM, DCM7-β-CD, qui, en présence de peptides fonctionnels modifiés par le 1 bromonaphtalène (P1-P4), subit un processus d'auto-assemblage ordonné pour donner naissance à des architectures supramoléculaires uniques sur le plan structurel, appelées Spds. Les images HRTEM et les analyses DLS ont révélé des morphologies de particules dépendantes des peptides avec des diamètres de ∼100 nm. Les Spds préparés à partir des sondes P1-P3 ont démontré une excellente perméabilité cellulaire, ce qui a facilité la délivrance intracellulaire de la sonde constitutive et permis l'imagerie cellulaire intracellulaire d'un biomarqueur d'apoptose (caspase-3) et des événements de mitose. Cette stratégie d'auto-assemblage a été étendue à l'inclusion d'un peptide antimicrobien et a permis d'améliorer l'efficacité de la sonde dans le cas des bactéries Gram positif et négatif. En outre, un Spd-4 fluorescent a été développé. Il a engendré une plus grande absorption cellulaire des bactéries par rapport au peptide seul. Cela s'est avéré vrai à la fois chez E. coli. (ATCC 25922) et S. aureus (ATCC 25923). Nous concluons donc que la stratégie d'administration de Spd décrite ici pourrait avoir un rôle à jouer pour surmonter les limites des peptides fonctionnels bioactifs. En fin de compte, cela pourrait conduire au développement d'agents diagnostiques et thérapeutiques plus efficaces à base de peptides.

Glycomacrocycles photocommutables (J. Xie, S. Maisonneuve)

Nous avons tout d'abord développé une approche de macrocyclisation médiée par une O-alkylation en un seul pot pour la synthèse d'azobenzènes macrocycliques à base de glucides. Les macrocycles synthétisés peuvent être isomérisés de manière réversible entre les isomères E et Z sous irradiation UV ou visible avec une excellente photostabilité et stabilité thermique. Un transfert de chiralité de l'unité de sucre chirale à l'azobenzène a été observé par dichroïsme circulaire (CD). Des calculs DFT et TD-DFT ont été effectués pour obtenir la géométrie optimale et les spectres théoriques d'absorption et de CD. La comparaison des spectres CD expérimentaux avec les spectres théoriques suggère que les macrocycles E et Z adoptent préférentiellement une hélicité P pour la partie azobenzène. En outre, l'un des macrocycles a montré une capacité de gélification dans le cyclohexane et l'éthanol avec un comportement répondant à des stimuli multiples lors de l'exposition à des sollicitations environnementales thermiques, lumineuses et mécaniques. De plus, ces organogels présentent une inversion hélicoïdale dépendante de la température, qui peut être contrôlée par une procédure répétée de chauffage et de refroidissement.
Nous avons utilisé avec succès ces glycomacrocycles photosensibles comme dopant chiral de cristaux liquides. Nous avons démontré le contrôle dynamique des superstructures hélicoïdales en réponse à un stimulus lumineux de cristaux liquides cholestériques (CLC) photoréceptifs dopés avec des dérivés glycomacrocycliques d'azobenzène qui présentent de grands changements de conformation. Un raccourcissement sans précédent de la longueur du pas de l'hélice et l'augmentation du pouvoir de torsion de l'hélice jusqu'à 500% sont observés lors de la photoisomérisation E→Z. Le comportement dynamique de torsion et de détorsion de l'hélice induit par la lumière fournit le premier exemple de CLC à base de glycomacrocycliques fonctionnalisés par des azobenzène, qui peuvent entraîner le mouvement mécanique de micro-objets. Deux modes de rotation - mouvement rotatif bidirectionnel ou unidirectionnel (mode vilebrequin) - sont réalisés. En particulier, le second mode basé sur la transition réversible de la texture cholestérique entre bandes homogènes et coniques focales conduit à l'accumulation des angles de rotation permettant les mouvements mécaniques amplifiés.
Par la suite, nous avons synthétisé sept nouveaux glycomacrocycles photosensibles par glycosylation intramoléculaire, ce qui élargit la bibliothèque de cycloazobenzènes chiraux. Une excellente α-stéréosélectivité peut être obtenue en utilisant des modèles p- et o-dihydroxy azobenzène, démontrant la preuve de concept de l'utilisation d'un modèle photosensible pour réaliser la difficile 1,2-cis glycosylation. La photoisomérisation E→Z a principalement influencé l'efficacité de la glycosylation intramoléculaire. Des propriétés chiroptiques ont été observées pour deux des macrocycles azobenzène o-substitués avec une inversion de la chiralité hélicoïdale lors de la photoisomérisation E→Z pour l'un d'entre eux.

Sondes fluorescentes pour les neurosciences (I. Leray, C. Mongin)

La compréhension des phénomènes biologiques dans le cadre de la transmission synaptique demeure d’un intérêt majeur dans le domaine des neurosciences. Dans le cadre d’une collaboration avec le groupe de N. Rouach (CIRCB-UMR7241, Collège de France), nous allons développer de nouvelles sondes fluorescentes afin de suivre le comportement des neurones et des astrocytes dans le cadre de la transmission synaptique. Ces travaux ont été amorcés dans le cadre du travail sur les sondes fluorescentes sélectives du potassium. Il s’agit de pouvoir suivre en temps réel lors d’expériences d’électrophysiologie des variations du potassium extracellulaire. En particulier, l’étude du dysfonctionnement de canaux ioniques est très importante dans la compréhension de certaines pathologies comme par exemple l’épilepsie. Nous nous intéresserons à la synthèse de traceur fluorescent de neurotransmetteurs connus. Nous avons synthétisé des analogues de la glutamine comportant une rhodamine qui ont été incorporés dans les astrocytes d’un cerveau de souris, permettant d’identifier par la fluorescence une protéine responsable de la transmission de la glutamine. Nous envisageons de développer des composés analogues de la glutamine dont la fluorescence est modifiée lors du passage de la forme glutamine à la forme glutamate. D’autres composés comportant la D-sérine seront également synthétisés.

Molécules, polymères et nanoparticules fluorescents pour l’imagerie et la détection (G. Clavier)

Les nanovecteurs (NVs) de médicaments devraient profondément modifier le traitement de maladies courantes telles que la polyarthrite rhumatoïde. Améliorer l'efficacité des NVs passera par une sélection des patients via l’imagerie de l'accumulation. Le projet CAP-PHOTOAC vise à préparer des NVs ayant une pertinence clinique marqués avec des composés organiques agents de contraste pour l'imagerie photoacoustique (IPA). L'IPA est une modalité émergente capable de cartographier (profondeur cm, résolution ~ 0,1 mm) l'absorption optique in vivo. De nouveaux absorbeurs moléculaires seront synthétisés pour marquer des NVs polymériques. Des fluorophores sensibles au pH seront également préparés et intégrés aux NVs pour étudier leur pénétration cellulaire. Stabilité, biocompatibilité, propriétés photophysiques et photoacoustiques des NVs seront caractérisés. Leur cinétique d’accumulation intratissulaire et intracellulaire sera imagée dans un modèle de souris par IPA et imagerie de fluorescence.