Soutenance de thèse de Mariah Harris

Titre

Biosenseurs Optiques Fluorescents : Un Nanoutil Prometteur pour la Détection Précoce dans les Systèmes Biologiques.

 

Résumé

Face à la crise sanitaire mondiale que représentent à la fois les bactéries résistantes aux antibiotiques (AMR) et le cancer, il existe un besoin urgent de méthodes de détection précoce améliorées. Les biocapteurs optiques fluorescents à base de nanoparticules fluorescentes (FNPs) offrent facilité de fonctionnalisation de surface, biocompatibilité, sensibilité et sélectivité. Des études antérieures ont démontré l'utilisation de nanoparticules polymériques fluorescentes couplées à un capteur de pH comme capteurs optiques double-ratiométriques pour la détection d'Escherichia coli (E. coli). Dans ce travail, nous étudions des nanoparticules polymériques fluorescentes vertes (G-FNPs) constituées d'un coeur fluorophore BODIPY vert et de coquilles polymériques hydrophiles composées de poly(oxyde d'éthylène) et de poly(acide acrylique), portant un groupement 4-dibenzocyclooctynol (DIBO). Le greffage d'un fluorophore sensible au pH, la X-rhodamine Ruby, par chimie click de cycloaddition azoture-alcyne promue par tension de cycle (SPAAC), a permis la création d'un biocapteur fluorescent ratiométrique.
La première partie porte sur les propriétés photophysiques des G-FNPs, du senseur Ruby libre, et du Ruby greffé sur les G-FNPs (nommées « particules greffées » – GPs), étudiées par mesures stationnaires et résolues en temps. Dans l'eau ultrapure (pH ~6,4-7,4), les propriétés photophysiques des G-FNPs et du Ruby étaient conservées dans les GPs. Dans des tampons citrate-phosphate (pH 4-8), les GPs ont présenté un comportement ratiométrique dépendant du pH, avec un rapport de fluorescence plus élevé en conditions acides et un pKa apparent de 4,9 ± 0,2. Les GPs ont également montré une réversibilité du pH entre conditions basiques et acides. Les mesures résolues en temps ont révélé une diminution du temps de vie de fluorescence des G-FNPs en présence de Ruby, indiquant un possible transfert d'énergie par résonance de type Förster (FRET) entre les deux composants.
Dans la deuxième partie, les GPs ont été étudiées en présence de cellules bactériennes et eucaryotes. Les GPs et les G-FNPs n'ont montré aucune toxicité envers les bactéries Gram-positives et Gram-négatives. De plus, les GPs ont détecté une production accrue d'acides par E. coli en présence de glucose, via une augmentation du rapport de fluorescence, et ont montré une sensibilité à la croissance bactérienne en cuvette durant les deux premières heures. Pour les cellules eucaryotes, les G-FNPs et les GPs n'ont montré aucun effet toxique sur les lignées cellulaires non cancéreuses (COS-7) et cancéreuses (HeLa), ceci a été évalué par l'activation des caspases-3/7 en microscopie de fluorescence. L'internalisation cellulaire passive des GPs a été étudiée à différents temps d'incubation, et la détection intracellulaire des GPs dans les cellules COS-7 et HeLa a été examinée avec et sans saponine.
La troisième partie porte sur la fabrication de surfaces luminescentes par immobilisation des G-FNPs et de la Ruby sur du verre silanisé. Ces surfaces ont été testées en tampons citrate-phosphate pour la détection du pH, mais un photoblanchiment irréversible a empêché un étalonnage fiable du pH. La stratégie d'immobilisation a ensuite été étudiée en utilisant la chimie click SPAAC pour greffer une gamme de colorants fonctionnalisés par un azoture, issus de différentes familles de fluorophores, produisant des surfaces luminescentes dont l'émission couvre l'ensemble du spectre visible. Parmi ceux-ci, la ROX et le BDP-TR ont montré le meilleur potentiel de FRET avec les G-FNPs.
Enfin, la quatrième partie présente des travaux préliminaires sur de nouveaux fluorophores sensibles au pH, tels qu'un fluorophore BODIPY sensible au pH et un HRuby PEGylés, pour le développement de futurs biocapteurs optiques. Globalement, ce travail établit une plateforme modulaire de nanoparticules fluorescentes adaptable à divers fluorophores, ouvrant la voie à de futures applications de biodétection.

Direction de thèse

• Directrice : Pr Rachel Méallet, Professeure, ISMO, Université Paris-Saclay
• Co-directeur : Dr Gilles Clavier, Directeur de Recherche, PPSM, CNRS

Composition du jury

• Thomas Pons Chargé de Recherche, PSL université, Rapporteur

• Thanh Ha Duong, Maîtresse de conférences, Université Paris-Cité Rapporteure

• Marie Erard, Professeure, Université Paris-Saclay, Examinatrice

• Christine Goze, Professeure, Université Bourgogne Europe, Examinatrice

• Donal O’Shea, Professeur, Royal College of Surgeons in Ireland, Examinateur